On accède au musée par la nef gauche de la basilique, à côté des salles de la sacristie principale. Le musée abrite des reliques sacrées et des artefacts d'une valeur inestimable, avec des pièces ayant survécu aux pillages des Sarrasins en 846, des lansquenets de Charles Quint en 1527 et des troupes napoléoniennes en 1797, et enrichies de nouvelles œuvres. Parmi les découvertes, citons la Colonne Sainte, une colonne byzantine sur laquelle, selon la tradition, le Christ se serait appuyé dans le temple de Salomon, œuvre en réalité du IVe siècle , le coq en métal doré (IXe siècle) qui était au sommet de l'ancienne basilique Saint-Pierre , une splendide dalmatique historiée dite de Charlemagne, en réalité œuvre byzantine du XIe siècle , la Crux Vaticana, don de l'empereur d'Orient Justin II à Rome (VIe siècle) parsemée de pierres précieuses. Le monument très élaboré de Sixte IV, orné des figures de Rhétorique, Grammaire, Perspective, Musique et Géométrie, est un chef-d'œuvre de Pollaiolo (1493), tandis que le sarcophage de Junius Bassus, préfet de Rome en 359, découvert à la fin du XVIe siècle près de la confession de la basilique, est décoré de scènes de l'Ancien et du Nouveau Testament.